1 de abril de 2013

SHORT TIPS: Eletroforese em gel de agarose

Quem trabalha com biologia molecular faz pelo menos alguns géis de agarose por semana. Ainda que seja uma técnica simples e de rotina, existem alguns "pulos do gato" para você conseguir resolver os fragmentos de DNA corretamente e ainda obter aquela "foto de livro didático"! Eu já dei algumas dicas por aqui antes, mas vamos ver mais algumas.

Concentração de agarose. A primeira coisa importante é usar a concentração de agarose adequada para separar os fragmentos de DNA analisados. Neste link, você pode descobrir a concentração recomendada para cada faixa de tamanho de DNA. Em alguns casos, quando os fragmentos forem muito pequenos, pode ajudar usar uma agarose de alta resolução.

Quantidade de DNA aplicado. Ninguém quer se dar ao trabalho de correr um gel e depois se deparar com uma banda muito fraca. Mas aplicar DNA demais pode resultar na famosa banda "smeared" (borrada). Em geral, de 100 a 200 ng para um poço de 1 mm é suficiente. O volume de amostra também é importante, deve preencher pelo menos 1/3 do poço e deve ser igual ao volume de padrão aplicado. Isso irá evitar a formação de bandas curvadas e differenças entre a migração do padrão e das suas amostras.

Se a sua amostra contém alguma enzima que se liga ao DNA, como ligases e enzimas de restrição, estas proteínas podem alterar o padrão de migração do DNA e gerar aquelas bandas tortas que a gente tanto detesta. A solução é adicionar SDS (concentração final 0.01%) para romper as interações destas proteínas com o DNA. Após adicionar o SDS, aqueça as amostras a 65ºC por 10 minutos, coloque-as em em gelo e depois aplique no gel.

Por fim, se você costuma usar brometo de etídeo, na minha opnião a forma de usá-lo que fornece os melhores resultados é adicioná-lo no gel ou com a amostra. Existem corantes menos tóxicos (e mais sensíveis), mas alguns podem alterar o padrão de migração do DNA, então é sempre bom testar antes de decidir mudar para um novo corante.


Nenhum comentário: