23 de novembro de 2011

RNAse Free "nas nuvens"



Se você é dependente da internet como eu, todos os dias também deve se deparar com a avalanche de informações que vem assim que damos o primeiro click: notícias do dia (e dos últimos segundos), e-mails, redes sociais, mais e-mails, blogs, revistas, livros, artigos,...É difícil selecionar o que é importante, sem gastar algum tempo com o que não é. A "nuvem de palavras" (“word/tag cloud", em inglês) é uma forma bem interessante de lidar com isso e obter uma boa perspectiva geral do conteúdo de um texto ou site. Funciona assim: a nuvem é formada pelas palavras mais frequentes do texto/site analisado, sendo a relevância de cada palavra indicada pelas cores e tamanho da fonte. Uma idéia simples, mas muito útil. Do tipo que nos faz pensar: “Por que eu não pensei nisso antes?”. Vejam abaixo, a nuvem de palavras do RNAse Free que eu fiz no Wordle (clique na imagem para ampliá-la).




RNA, DNA, sequenciamento, degradação, primer? Quem conhece blog deve concordar que diz muito sobre ele. É claro que a nuvem de palavras não substitui a leitura completa do texto, mas ajuda a encontrar a informação que você procura mais rapidamente...além de ser visualmente mais atrativo do que dezenas e dezenas de páginas indevassadas. Todos os sites (e blogs) deveriam ter uma. Eu vou já providenciar uma nuvem de tags com hiperlinks para o RNAse Free...mas todos ainda terão que continuar lendo os posts (que acharem relevantes) até o fim! :)

19 de novembro de 2011

Troubleshooting: o que fazer quando o RNA está com a razão 260nm/230nm baixa?

Leitor RNAse Free (por e-mail): "Meu RNA está com muito contaminante, pois a razão 260/230 está bem baixa. Tenho que obrigatoriamente fazer extração por Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, então gostaria de saber se você tem alguma dica de como melhorar a pureza do meu RNA e que não interfira nos microRNAs. Vi que você escreveu sobre um protocolo com cloreto de lítio, você chegou a testar? Funciona?”




Identificando o problema
A contaminação indicada pela razão 260/230 baixa pode ser causada por diferentes compostos. No caso do método do Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, podem ser traços destes compostos ou ainda de sal, álcool ou, dependendo do tecido de origem, polissacarídeos. Eu recomendo você ler suas amostras também a 270 nm e calcular a razão 260/270 que indica contaminação por fenol. Esta razão deve estar em torno de 1.2. Se estiver muito abaixo deste valor, então sua amostra está realmente contaminada com traços do reagente de extração (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio). Mas se não, é mais provável que sejam traços de sal, etanol ou polissacarídeos.


O que fazer?
Para evitar que sua amostra seja contaminada com o reagente de extração de RNA (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio), é preciso tomar muito cuidado na etapa de remoção do sobrenandante (a fase aquosa que contém o RNA e que se forma após a primeira etapa de centrifugação). É um pouco de prática. É preciso remover o sobrenandante sem se aproximar muito da interface. No entanto, é impossível remover todo o sobrenadante sem trazer um pouco de DNA genômico (a nuvem branca entre as fases orgânica e aquosa) e da fase orgânica (rosa, que fica na parte inferior do tubo). Então, nesta hora, é melhor perder um pouco de sobrenadante, mas ter certeza que todo o sobrenandante recolhido não está contaminado. 


Se você quiser tentar salvar suas amostras já contaminadas sugiro que você faça uma nova purificação com Fenol/Clorofórmio seguida de precipitação com etanol/acetato de sódio e lavagem com etanol 70%. Esta nova purificação com solvente orgânico irá remover os traços de fenol/clorofórmio. Mas, novamente, é preciso muito cuidado na remoção do sobrenadante.
Mas se suas amostras estiverem contaminadas com sal ou álcool basta fazer uma nova precipitação (adicionando 2.5 volumes de etanol absoluto e 1/10 volumes de acetato de sódio 3M) e em seguida lavando o pellet com etanol 70%. A maioria das pessoas tem pavor de vortexar os tubos nesta etapa de lavagem. Mas a não ser que seu pellet não seja visível, você deve vortexar gentilmente para lavar bem o pellet e remover o excesso de sais. Eu costumo fazer esta etapa pelo menos duas vezes.


Purificação com cloreto de lítio
Eu sempre faço a purificação com cloreto de lítio em todas as minhas amostras de RNA extraídas com Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio. Funciona mesmo. O RNA fica bem mais limpo e é essencial para amostras que possam estar contaminadas com polissacarídeos, como aquelas extraídas a partir de tecido muscular, por exemplo. No entanto, o cloreto de lítio não precipita de forma eficiente microRNAs. Então, não recomendo que você inclua esta etapa nas suas extrações, já que você tem interesse nesse tipo de RNA.


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Envie suas perguntas na forma de comentários ou por e-mail (blog.rnase.free @ gmail. com) e suas dúvidas poderão dar origem a um post na sessão "Troubleshooting" do RNAse Free.