23 de março de 2008

RNA quality control


Mas o que é um RNA de qualidade? Em primeiro lugar, como ficou evidente no último post, um bom RNA deve estar íntegro (as moléculas não devem estar fragmentadas). Além disso, o RNA deve estar puro, ou seja, livre de contaminantes como sais, etanol, lipídeos, polissacarídeos, proteínas, fenol, clorofórmio e outras substâncias que podem estar presentes nas soluções utilizadas na sua extração ou no tecido de origem. Isto é especialmente importante no caso em que o RNA será utilizado em reações enzimáticas, uma vez que estas exigem condições químicas específicas, além de serem suscetíveis a inibição por uma série de compostos.





Para avaliar a pureza de uma amostra de RNA, assim como para quantificá-lo, a opção é obter o espectro de absorbância da amostra utilizando um espectrofotômetro. Nos aparelhos tradicionais, a amostra é colocada em uma cubeta, o que exige um volume considerável de amostra, mesmo estas sendo diluídas. Com um espectrofotômetro mais moderno, como o Nanodrop (não estou fazendo propaganda), é necessário utilizar apenas 1 ul de amostra para se obter um espectro completo, preciso e quase sempre sem que seja necessário diluir a amostra, além de detectar concentrações de RNA ínfimas como 2 ng/ul. Em 10 segundos, você tem na tela um gráfico mostrando o espectro (220-750 nm) além de outras informações como concentração de RNA, razões 260/280, 260/230, etc.




O pico de absorbância do RNA é a 260 nm (Uma leitura a 260nm igual a 1.0 equivale a 40 ug RNA/ml). Uma amostra de RNA deve exibir uma curva em formato de sino, com um único pico em 260 nm. Proteínas apresentam um pico de absorbância a 280 nm e outros contaminantes (como sais, polissacarídeos e compostos orgânicos como fenol) apresentam pico de absorbância em torno de 230 nm. Por isso, a razão das abs. 260/280nm é freqüentemente utilizada para avaliar a contaminação por proteínas, sendo o valor de referência (amostra livre de proteínas) igual a 2.0 (o que varia um pouco na literatura). E a razão das abs. 260/230nm é utilizada para avaliar a contaminação por outros compostos (valor de referência também em torno de 2.0 – e também não é consenso). Logo, seu RNA está OK se a curva obtida for parecida com a vermelha no gráfico abaixo.



Para avaliar a integridade do RNA é possível utilizar, principalmente, três abordagens:


1) Submeter o RNA a eletroforese em gel de agarose em condições desnaturantes (existem diferentes protocolos disponíveis);


2) Realizar northern blot para algum gene housekeeping altamente expresso (como por exemplo, actina), embora esta técnica não seja mais muito usada como meio de avaliação da expressão gênica, ainda pode ser útil neste contexto;


3) Analizar o RNA através de um bioanalyzer (sistema de eletroforese em capilares).




Através de um gel de agarose desnaturante, é possível deduzir a integridade do RNA através da visualização das bandas de RNA ribossomal. A presença de rastro abaixo das bandas de rRNA indicam degradação e, acima delas, pode indicar contaminação por DNA genômico (o que pode comprometer resultados futuros). Portanto, um RNA legal deve apresentar bandas bem definidas e sem rastros (como na foto por trás do título do blog :-). Além disso, a banda referente ao rRNA 28S deve apresentar o dobro da intensidade da banda do rRNA 18S. Este parâmetro tenho sido bem utilizado (através do cálculo da razão entre as intensidades das bandas 28S/18S que deve ser igual a 2.0, mas este valor pode variar entre diferentes espécies e tecidos). No entanto, esta técnica exige uma quantidade considerável de RNA (pelo menos, 1 ug, o que pode ser limitante para alguns), além de somente detectar um grau considerável de degradação (suficiente para exibir um rastro no gel e alterar a razão 28S/18S calculada a partir da análise da imagem dele) e demandar mais tempo e trabalho.


Por fim, o bioanalyzer tem sido considerada a melhor opção, mas ainda não é um equipamento comum nos laboratórios. Exige pequenas quantidades de RNA (até 200 pg de RNA total!) e utiliza um corante fluorescente que permite avaliar tanto a integridade quanto a concentração de RNA na amostra. O princípio é o mesmo de uma eletroforese em gel de agarose, mas a corrida é feita em um capilar contendo o polímero e é gerado um eletroferograma (a direita do gráfico abaixo) o qual é analisado automaticamente pelo aparelho que detecta qualquer traço de degradação. O resultado é exibido na forma de um gráfico, como o abaixo, através do qual é possível calcular a razão 28S/18S com maior precisão a partir dos respectivos picos. Além disso, existem softwares que utilizam um algoritmo para analisar os resultados obtidos e atribuir à amostra uma pontuação (RIN – RNA Integrity Number) que varia de 1 a 10. Coisa de primeiro mundo!

O que eu escrevi aqui é pouquíssimo perto da quantidade de informação disponível sobre o assunto, para saber mais acesse os links abaixo. Em qualquer site de busca em periódicos (pubmed, science direct, web of knowledge, etc) é possível encontrar bons artigos sobre o assunto.
No próximo post, eu pretendo falar sobre como tenho avaliado a qualidade das amostras de RNA total que tenho extraído, dos resultados obtidos e de algumas modificações que fiz no protocolo de extração para melhorar a qualidade das amostras.
Links relacionados:

21 comentários:

Eliane, a Lia disse...

texto muuuuuuuuuuito bom!!!

Anônimo disse...

Gostei da sua explicação. Bem objetivo! Poste mais assuntos relacionados ao PCR.

Anônimo disse...

Gostei da sua explicação! Ficou bem objetiva! Poste mais assuntos relacionados a biomol.

Juliana Americo disse...

Obrigada! Tentarei aumentar a frequência de posts.

Abs

António Manuel Santos disse...

Parabens por este texto, mas ilicidativo e interessanteque uma sebenta universitária.

Juliana Americo disse...

Obrigada, Antonio!

letícia carvalho disse...

Oi Juliana, eu estou tentando fazer o gel para ver a integridade do RNA mas meu gel não aparece nada, nem banda, nem rastro. Vc tem alguma ideia do por que q isso acontece?

Juliana Americo disse...

Oi Leticia, quantas nanogramas de RNA voce aplicou no gel? Pode ter sido pouco. O minimo, com brometo de etidio, é de 200 ng, mas eu costumo aplicar entre 500 e 800 ng. Um abraço, Juliana

Anônimo disse...

Oi Juliana, tenho testado diversos kits para a extração de RNA de raízes de milho. As quantificações em nanovue têm demonstrado concentrações em torno de 300 a 500 ng/uL, com relações de 1,8 a 2,2. Porém, quando faço o gel de agarose para verificar a qualidade do RNA extraído, são verificados apenas rastros ou manchas nas amostras e não aquele padrão esperado de duas bandas. O que você acha que pode estar acontecendo?
Obrigada pela atenção!

Juliana Americo disse...

Olá! As suas amostras são frescas ou estavam armazenadas de alguma forma? No caso de amostras antigas, pode acontecer de o RNA já estar degradado e, portanto, seria algo independente da sua extração. Se suas amostras são frescas, o RNA está sendo degradado durante o processo de extração ou mesmo após a extração e isso pode ter várias causas:
- Contaminação das amostras ou dos reagentes e plásticos utilizados com RNAses (dê uma olhada neste post:http://rnasefree.blogspot.com.br/2008/03/o-pesadelo-das-rnases.html)
- Contaminação da água ou tampão utilizada para ressuspender o RNA com RNAses (use sempre água ou o tampão indicado RNase Free).
- Mal armazenamento do RNA: se for guardar o RNA em freezer -20ºC, costumo mantê-los sempre em solução precipitante (em 2.5V de etanol e 1/10 colume de acetato de sódio 3M), em freezer -80°C, o RNA pode ser mantido em água.
- O RNA pode estar sendo degradado durante a corrida de eletroforese. Eu uso o protocolo de Masek (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15582557) e evite usar voltagens elevadas que podem aquecer o tampão de corrida e resultar na degradação do RNA.
Além disso, mantenha sempre suas amostra em gelo para evitar degradação.
Abraços
Juliana

Anônimo disse...

Oi Juliana! Parabens pelo blog!

Veja se vc pode me ajudar, por favor... eu extraio RNA de tecidos animais por Trizol... qd analizo no nanodrop, a relaçao e a curva estao ok... mas no gem aparecem mais bandas do que as esperadas (aparecem varias)... o que significa isso e o que eu esto fazendo de errado na extraçao?

Muito obrigada!!!

Anônimo disse...

Oi Juliana! Parabens pelo blog!

Veja se vc pode me ajudar, por favor... eu extraio RNA de tecidos animais por Trizol... qd analizo no nanodrop, a relaçao e a curva estao ok... mas no gel aparecem mais bandas do que as esperadas (aparecem varias)... o que significa isso e o que eu estou fazendo de errado na extraçao?

Muito obrigada!!!

Juliana Americo disse...

Olá,
obrigada!

Em relação ao seu problema, você analisou as suas amostras em um gel em condições desnaturantes? Pois se não foi, as múltiplas bandas visualizadas pode apenas ser resultado da formação de estruturas secundárias no RNA que alteram o seu padrão de corrida no gel...
Mas se o gel foi feito em condições desnaturantes e ainda assim você visualizou mais bandas do que deveria, isso é sinal que o seu RNA degradou em algum momento desde o armazenamento do tecido até a obtenção e armazenamento da amostra de RNA. Você pode ler um pouco sobre este tipo e problema neste post: http://rnasefree.blogspot.com.br/2008/03/o-pesadelo-das-rnases.html

Abraços
Juliana

Helder Freitas disse...

Ótimo!!!!

Aline Silva disse...

Ola juliana em meu trabalho o 260/280 em RNA esta variando 0,78 á 1,67
te pergunto esta bom estes numeros? porque aqui na sua pagina afirma 2 e na literatura que vi aforma entre 1.8 á 2. Estes valores que obiteve podem ser considerados?

Juliana Americo disse...

Oi Aline,
Eu concordo com o intervalo 1.8 a 2.0 para razões 260/230 e 260/230. Valores abaixo de 1.8 para 260/280, como no seu caso, indicam contaminação com proteínas. A sua razão 260/230 é normal (acima de 1.8)? O problema é que com a contaminação com proteínas, você poderá estar superestimando a concentração de RNA (caso esteja calculando a concentração de RNA com base no valor de DO 260 nm. Além disso, esta contaminação pode inibir reações enzimáticas posteriores (por exemplo, retrotranscrição). Portanto, o recomendável é obter amostras com valores de 260/280 = ou > 1.8.
Abraços
Juliana

Anônimo disse...

Oi, Juliana! Muito esclarecedor essa matéria!
Gostaria de saber, se as razões 260/280, 260/230 para presumir a qualidade também se aplicam para DNA , e aproveito para sanar outra dúvida, não se pode fazer PCR direto de RNA?pq?

Juliana Americo disse...

Olá! Sim, as razões também se aplicam ao DNA. Quanto a fazer PCR direto de RNA, não é possível pois a enzima DNA polimerase usa apenas DNA como "molde" para a polimerização do DNA e, por isso, o RNA precisa primeiramente ser convertido em cDNA

Anônimo disse...

Muito obrigada, Juliana!! Me ajudou bastante, esse blog é valiosíssimo!
Grande abraço!

Anônimo disse...

Oi Juliana. Tudo bem?
Eu extraio RNA de tecido vegetal (folhas) através do reagente Pure Link Plant RNA. Porém, quando vou verificar a qualidade das amostras extraídas através do gel de agarose, meu resultado é de apenas 1 banda ribossomal. Tenho feito vários testes e ainda sem êxito. Sabe me dizer o que pode estar acontecendo de errado?

Juliana Americo disse...

Olá,

Uma possibilidade é degradação parcial da sua amostra.
Você sabe o tamanho aproximado da única banda observada no gel de agarose? O tamanho é compatível com RNA ribossomal? Se a banda for de tamanho muito superior, também é possível que seja contaminação por DNA genômico...

Algumas espécies exibem este padrão de apenas uma banda de RNA ribossomal no gel de agarose desnaturante, mas nunca ouvi falar sobre isso em plantas (http://rnasefree.blogspot.com.br/2008/04/para-onde-vai-o-rrna-28s-dos-bivalves.html)

Abs

Juliana